均相酶免疫法檢測血清甘膽酸的方法學評價

【摘要】目的：對均相酶免疫法檢測血清甘膽酸（CG）進行方法學評價。方法：用生化分析儀和均相酶免疫法測定CG，完成精密度、線性分析、回收試驗及干擾試驗，同時與放射免疫測定法進行比對試驗。結果：該法批內、批間的變異系數均<5.0%，在0～60ug/ml范圍內線性良好，相關方程為Y=1.014X-0.194，r=0.999；平均回收率為95.6%；50g/L血紅蛋白、8.0mmol/L甘油三酯、100.0umol/L膽紅素對結果干擾均<5.0%；與放射免疫測定法結果比對，回歸方程為Y=1.030X-0.086, r=0.968，兩者具有高度相關性。結論：該法重復性好，線性范圍寬，抗干擾能力強，與放射免疫分析法檢測結果具有高度相關性，適合在生化分析儀上進行自動分析。

【關鍵詞】 甘膽酸 均相酶免疫法 方法學評價

CG是肝臟以膽固醇為原料合成的膽酸再與甘氨酸結合而成。當肝細胞受損傷、肝占位病變或膽汁淤積時，可引起CG代謝和循環紊亂，使血清中的CG量增加，CG測定廣泛應用于肝病及妊娠期肝內膽汁淤積癥的診斷與治療[1-2]。

1． 材料與方法

1.1 試劑與儀器 均相酶免疫法CG試劑、校準品及質控品為安徽伊普諾康生物工程有限公司產品，采用日立7180分析儀完成相關檢測。放射免疫法CG試劑為北京原子高科股份有限公司產品，采用CN20放免分析儀完成相關檢測。

1.2 實驗標本 為住院患者及健康體檢者當天采集的血清，共50例，其中異常結果占25%，所有標本無溶血，無脂濁。

1.3 實驗方法 嚴格按照儀器操作、試劑說明書及實驗室技術操作規程進行檢測。CG均相酶免疫試劑的分析參數：雙波長340/405nm，試劑與標本比20:1，校準方法為多點定標。

1.4 統計學分析 以統計軟件SPSS12.0對檢測數據進行統計分析。

2． 結果

2.1 精密度分析

批內精密度：分別測定三個不同濃度的CG質控品，3h內重復測定10次，計算均值、SD及CV。

批間精密度：用三個不同濃度的CG質控品分別測試3個不同批號的試劑，每個批號重復測試10次，計算均值、SD、 CV。精密度結果見附表1

附表1：均相酶免疫法測定CG的批內、批間精密度結果（ug/ml）

質控品濃度	批 內 x±s CV%		批 間 x ±s CV%
4.00	3.78±0.09	2.43	3.84±0.15	3.92
17.00	17.43±0.16	0.90	17.63±0.37	2.12
40.00	41.63±0.27	0.65	41.62±0.93	2.24

2.2 線性分析（ug/ml）

選取一份接近預期上限的標本重復測定3次，取均值作為理論值，然后用蒸餾水稀釋形成梯度濃度的實驗樣本，將實驗樣本進行測定，每個濃度重復測定3次，計算均值。以樣本的理論值為自變量，實測值為因變量作線性回歸分析，CG線性分析結果見附表1。

附表2：CG線性分析結果（ug/ml）

預期值	測定值	相關性分析
2.50	2.72	Y=1.014X-0.194 r=0.999
5.00	5.26
10.00	9.56
20.00	19.85
40.00	39.62
60.00	61.21

2.3 回收試驗

取混合血清標本（濃度為2.80ug/ml），分為4份，每份500ul，其中1份加入25ul的生理鹽水，另外3份分別加入濃度為10.0、20.0、40.0、60.0ug/ml的CG標準液25μL，對每例樣本作雙次測定，取均值，計算回收率。CG回收試驗結果見附表3

附表3：CG回收試驗結果（ug/ml）

測定值	加入濃度	回收率	平均回收率
2.80	/	/	95.6%
3.28	0.48	95.3%
3.75	0.95	96.4%
4.70	1.90	96.0%
5.66	2.86	94.8%

2.4 干擾試驗

取混合血清標本（濃度為2.80ug/ml），分為4份，每份500ul，其中一份加入100ul生理鹽水,其它三份分別加入100ul的50.0g/L血紅蛋白液、8.0mmol/L甘油三酯、100.0umol/L膽紅素，對每例樣本作雙次測定，取均值，計算偏倚。CG干擾試驗結果見附表4。

附表4：CG干擾試驗結果（ug/ml）

干擾物濃度	測定結果	干擾濃度	偏倚%
未加干擾物	2.35	/	/
8.33g/L血紅蛋白	2.40	0.05	2.2%
1.33mmol/L甘油三酯	2.45	0.10	4.3%
16.67umol/L膽紅素	2.42	0.07	3.0%

2.5 比對試驗

選取住院患者及健康體檢者當天采集的血清共50例，其中異常結果占25%。分別用均相酶免疫法試劑和放射免疫法試劑完成CG檢測。兩種試劑CG檢測結果呈高度正相關（Y=1.030X-0.086, r=0.968）。

3． 討論

1959年Yalow及Berson創建了放射免疫分析法(RIA)，此法應用同位素標記及特異性高的抗原-抗體反應，對人體內的微量物質進行定量分析，其靈敏度可達到pg(10-12g)級水平，但RIA有其無法克服的放射性污染的缺點。1971年Engvall等在RIA原理的基礎上發展了一種新的免疫分析方法—酶標記免疫分析法（ELISA)，但ELISA操作較繁瑣，反應時間長，一般用于定性或半定量分析。1972年Rubenstein及Ullolan，在酶標記抗原競爭法的基礎上，創建了均相酶免疫分析方法(EMIT)[3]。

EMIT是利用酶作為標記物，在均勻的液相中進行的免疫分析技術。與其它用酶為標記物的免疫方法不同，EMIT不需要分離抗原抗體復合物，整個反應過程在均一的液相中進行，沒有酶量的變化，以酶活性的高低作為檢測的指標，這樣就能夠達到快速與簡便的要求[4]。

CG檢測方法有放射免疫分析法、膠乳免疫比濁法和均相酶免疫比色法。放射免疫分析法因為國家對同位素的嚴格管制以及放射性污染而逐漸被淘汰。膠乳免疫比濁法用于生化分析儀的自動化分析，具有靈敏度高、重復性好的特點，但膠乳顆粒具有較強的粘附性，容易污染比色杯并造成交叉污染。而均相酶免疫比色法不但具有膠乳免疫比濁法的優點，同時克服了其污染比色杯的弊端，為CG的自動化分析開辟了一條新的途徑，具有良好的發展前景。

EMIT法檢測CG原理：游離甘膽酸與葡萄-6-磷酸脫氫酶—甘膽酸偶聯物競爭性結合抗甘膽酸特異性抗體位點，樣本中游離甘膽酸越多，競爭結合抗體位點越多，抗體釋放出的酶標偶聯物就越多。游離出來的甘膽酸酶標偶聯物催化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD﹢)轉化為β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(NADH)。樣本中甘膽酸濃度與NADH生成量成正比，通過檢測340 nm波長的吸光度變化即可計算出甘膽酸含量[5]。

安徽伊普諾康生物工程有限公司生產的甘膽酸均相酶免疫法試劑盒，具有靈敏度高、準確度好、重復性佳、抗干擾能力強、線性范圍寬等特點，與放射免疫分析法的檢測結果有高度相關性。與放射免疫分析法和膠乳免疫比濁法相比，具有相當的反應靈敏度，同時克服了同位素的放射性污染和膠乳顆粒污染比色杯的弊端，是適合在生化分析儀上進行自動分析的理想生化試劑。

參 考 文 獻

1．楊禮彬．甘膽酸檢測的臨床應用．分析免疫與臨床[J]，1999，6（6）：116-117．

2．張銘，左偉，周洪興．清甘膽酸的測定在妊娠肝內膽汁淤積癥中的診斷意義及與胎兒預后關系．中國婦幼保健[J]，2005，20（19）：2521-2522.

3．陶涵．均相酶免疫分析簡述．藥學通報[J]，1987，12（22）：745-747．

4．劉奉亭．均相酶技術進展．國外醫學生物檢驗與檢驗學分冊[J]，1989，6（10）：11-13．

5．甘膽酸試劑盒使用說明書．安徽伊普諾康生物工程有限公司．