早在1000年以前，阿拉伯醫(yī)生Abulcasis（1013-1017）就發(fā)明了活檢技術(shù)。活檢的好處是醫(yī)生可以根據(jù)病灶組織學結(jié)構(gòu)對病情做出判斷。隨著近幾年測序技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)生可以對患者組織測序進而給出更加精確的診斷結(jié)果。

但隨著對腫瘤研究的深入，科學家發(fā)現(xiàn)在癌癥的診斷和治療過程中組織活檢技術(shù)有一定的局限性。主要表現(xiàn)為：腫瘤具有異質(zhì)性，對于癌細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者而言，僅僅取某個部位的腫瘤組織，并不能反映患者的整體情況，但對所有的腫瘤組織都取樣檢測又不切實際；某些患者自身的情況決定了他不適合做組織活檢；受到手術(shù)的擾動之后，有些腫瘤有加速轉(zhuǎn)移的風險；組織活檢的滯后性對患者的治療也是不利的。因此對于癌癥的診斷和檢測技術(shù)有更高的要求。

液體活檢技術(shù)的出現(xiàn)，解決了上述的問題，也提前了癌癥的診斷時間。這也是液體活檢技術(shù)被《麻省理工大學科技評論》評選為“2015年十大突破技術(shù)”的原因。

作為體外診斷的一個分支，液體活檢就是通過血液或者尿液等對癌癥等疾病做出診斷。其優(yōu)勢在于能通過非侵入性取樣降低活檢的危害，而且有效延長患者生存期，性價比高。目前液體活檢的主要檢測物包括檢測血液中游離的循環(huán)腫瘤細胞（CTCs），循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）碎片，循環(huán)RNA（Circulating RNA）和外泌體（攜帶有細胞來源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)，脂類，DNA，RNA等）。其中，ctDNA，RNA和外泌體是腫瘤細胞自身分泌或死亡時釋放的物質(zhì)。

下面我們對液體活檢檢測物及研究進展做簡要的介紹。

液體活檢主要檢測物

循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)

1869年，澳大利亞籍醫(yī)生Ashworth首次提出循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的概念。1976年，Nowell將CTCs的定義修正為來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并通過組織基質(zhì)進入血管的腫瘤細胞。目前，CTCs是指存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱。CTCs以不同形態(tài)存在于外周血中，既有游離的單個CTCs，也有聚集成團的細胞團（CTM，Circulating Tumor Microemboli），腫瘤細胞在進入外周血循環(huán)的過程中會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）。

CTCs轉(zhuǎn)移過程中必經(jīng)階段：

CTCs通過從腫瘤組織中脫落游走至血管，穿過血管進入血循環(huán)，克服自身及血循環(huán)中各種因素的殺傷作用，到最后定植形成新的轉(zhuǎn)移灶等多個生理步驟，使得CTCs可順利侵襲轉(zhuǎn)移從而促進相關(guān)疾病的進展。

CTCs的檢測：

對CTCs檢測包含細胞富集和細胞檢測兩部分，可以進行不同的組合，形成不同的技術(shù)。最常見的富集方法是抗體介導(dǎo)或物理方法富集，接下來進行免疫組織化學計數(shù)或遺傳分析。

A行顯示了磁珠-抗體富集方法；B行顯示了物理富集方法；C行顯示了最常用的細胞檢測方法。

血漿游離腫瘤DNA('Cell-Free' Circulating Tumor DNA，ctDNA

ctDNA（circulating tumor DNA）即循環(huán)腫瘤DNA是人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征（包括突變，缺少，插入，重排，拷貝數(shù)異常，甲基化等）來自腫瘤基因的DNA片段。一般來源于壞死或凋亡的腫瘤細胞，循環(huán)腫瘤細胞和腫瘤細胞分泌的外排體，但是在了解ctDNA之前，我們要知道另一個與之相關(guān)的概念—cfDNA。

cfDNA（cell-free DNA），或者叫血漿游離DNA，是血漿中游離存在的DNA，它們有的來自于正常細胞，有的來自于異常細胞（如腫瘤細胞），還有部分來自于我們外部（如病毒DNA）。

 

ctDNA的檢測：

數(shù)字PCR

將一個標準PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板)，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)。

BEAMing技術(shù)

結(jié)合數(shù)字PCR與流式技術(shù)，利用特異性PCR引物擴增目標突變區(qū)后，與磁珠（磁珠上固定有特異的PCR引物）混合進行油包水單分子擴增反應(yīng)。反乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結(jié)合磁珠上的PCR產(chǎn)物，發(fā)出紅色或綠色熒光，再利用流式細胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。

液體活檢的研究進展

液體活檢—治愈癌癥的可靠保障

近日，哈佛醫(yī)學院丹娜法伯癌癥研究院領(lǐng)導(dǎo)合作研究小組成功證實了液體活檢技術(shù)作為臨床工具識別特定病人的可行性。這種簡單液體活檢技術(shù)可快速且精準地檢測導(dǎo)致非小細胞肺癌(NSCLC)的兩種關(guān)鍵基因致病突變，進而幫助臨床醫(yī)生為病人制定針對上述兩種突變的化療藥單，提高非小細胞肺癌的臨床治療水平。“我們認為血漿基因分型在臨床測試中具有不可估量的應(yīng)用潛力，這種癌癥常規(guī)基因印記的快速與無創(chuàng)篩查可以避免對傳統(tǒng)侵入性的活組織檢查的挑戰(zhàn)。”丹娜法伯/布列根女性醫(yī)院肺癌專家Geoffrey Oxnard博士說。（原文：Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer）

Sci Transl Med：“液體活檢”可捕捉癌性突變

新國際著名雜志Science Translational Medicine在線刊登的一項新的研究報告中指出，一種新的基因測序技術(shù)可能比用傳統(tǒng)的腫瘤活檢技術(shù)檢測癌性突變更安全及廉價。這種叫做"TAm-Seq"的技術(shù)可通過收集血漿中循環(huán)DNA片段，放大與癌癥相關(guān)的DNA部分并深入挖掘基因序列來發(fā)現(xiàn)那些難以辨認的突變。Tim Forshew及其同事分析了來自一組晚期卵巢癌病人的腫瘤樣本并發(fā)現(xiàn)，有67%的病人帶有腫瘤抑制基因TP53的突變。

Cell：新型血檢技術(shù)或可擴大液體活檢的范圍

發(fā)表在Cell上的一篇報道中，華盛頓大學的科學家表示他們開發(fā)了一種新方法可以克服當前液體活檢技術(shù)的局限性，從而幫助鑒別哪些類型的細胞可以產(chǎn)生游離DNA；這種方法依賴于對個體機體中游離DNA的片段譜系的分析并將這種譜系信息同細胞多種死亡生理條件進行對比，可以擴大液體活檢的檢測范圍。

液體活檢技術(shù)使得癌癥早期階段的篩查成為可能，無論是腫瘤診斷，治療還是監(jiān)控領(lǐng)域，液體活檢的優(yōu)勢都使其成為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷手段，具有極高的臨床應(yīng)用價值和市場前景。

相關(guān)會議推薦

2016液態(tài)活檢與臨床應(yīng)用研討會

會議時間：2016.05.20-2016.05.21     會議地點：上海